Исследования в области быстропротекающих клеточных процессов стимулировали прогресс в развитии новых методов прижизненной микроскопии и необходимости регистрации динамических процессов. Большинство биологических объектов является прозрачными для излучения в оптическом диапазоне. С точки зрения физической оптики такой объект является амплитудно-фазовым и его внутренняя структура описывается трехмерными пространственным распределением показателя преломления и коэффициента поглощения Измерение этих оптических неоднородностей играет важную роль в исследовании клеточных культур, и предпочтительно проводить его без специфического окрашивания или введения флуоресцентных меток. С показателем преломления и коэффициентом поглощения связаны различные физические параметры клеток. По распределению показателя преломления можно определить вес сухих веществ в клетке и ее органеллах и места локализации инородных соединений. Можно наблюдать и динамические процессы в клетке, так как она остается живой, в частности, процессы синтеза и распада белков, а также определять традиционные морфологические параметры клеток.
К важнейшим параметрам фазового микрообъекта относится и оптическая длина пути (ОДП), представляющая собой интеграл от функции распределения показателя преломления вдоль зондирующего луча. По набору значений ОДП, измеренных при различных углах зондирования, можно реконструировать трехмерное пространственное распределение показателя преломления, являющегося локальным по пространству параметром фазового объекта. Из ОДП и трехмерного распределения можно вычислить различные производные характеристики от этих величин: плотность, концентрацию и морфометрические характеристики, например, объем и средний радиус клетки и т.п. Показатель преломления связан с поляризуемостью белковых структур клетки, следовательно, фазовое изображение несет ценную диагностическую информацию о состоянии биологического микрообъекта.
Другой задачей является формирование изображений прозрачных или полупрозрачных объектов, несущих количественную информацию об их структуре, а также наблюдение и оценка пространственных линейных масштабов и измерение их локальных и интегральных характеристик.
На сегодняшний день задача визуализации объемных фазовых объектов решается методами: фазового контраста или метода Цернике; интерференционного контраста, дифференциально-интерференционного контраста или метода Номарского; методом темного поля; поляризационного контраста и градиентной фазовой микроскопии.
Современный уровень исследований требует количественной информации о сверхмалых изменениях при трехмерной визуализации всего изучаемого препарата. Высокая чувствительность к изменениям оптической разности хода (ОРХ) достигается при фазовых измерениях.
Количественные исследования характеристик фазовых микрообъектов можно проводить с помощью интерференционных микроскопов. Возможно проводить мониторинг состояния как отдельной клетки, так и целой популяции клеток. Корреляция между различными процессами, происходящими в живой клетке, и величиной ОРХ позволяет использовать фазовое изображение также для исследования этих динамических процессов.
Для проведения измерений в основном используют микроскопы, в основе которых лежат различные схемы двухлучевых интерферометров: Майкельсона, Маха-Цендера и Миро. В области интерференционной микроскопии актуальной является также проблема разработки методов оптической микротомографии фазовых объектов, обеспечивающих большой угол зондирования, различные траектории сканирования и большое число проекций.
Одной из разновидностей интерференционной микроскопии является квантово-фазовая визуализация (QPI), в ходе которой происходит удаление гало-артефакта из метода классической фазово-контрастной микроскопии. QPI состоит из 2-х технологий: Light Interference Microscopy (SLIM™), Gradient Light Interference Microscopy (GLIM™) . SLIM™, GLIM™ измеряют оптическую длину пути, измененную при прохождении сквозь образец, регистрируют в значениях пикселов полученного изображения. Интенсивность пикселя пропорциональная изменению в оптической длине, что позволяет проводить измерения морфологических характеристик, рефрактивного индекса и сухой массы объекта.
Технологии SLIM™, GLIM™ сочетают метод фазовой визуализации с низкокогерентной интерферометрией и голографией c сохранением геометрии оптического пути. Это обеспечивает высокое отношение сигнал/шум (нанометрическая фазовая чувствительность) и малошумный фон (временная стабильность) по сравнению с методами фазового контраста (ПК), дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) или другими QPI-методами. SLIM™, GLIM™ и технологии используют белый свет микроскопа, что позволяет избежать спеклов, которые возникают в QPI-методах при использовании лазера, и улучшают оптическое разделение из-за низко-когерентной длины волны источника света. Пропускная способность для осуществления измерений является высокой (до 100 микролитров измеряемого объема в минуту) при одновременном обеспечении субмикронного разрешения при высокой плотности пробы (до 1010 частиц/мл).
