В современных научных исследованиях активно применяется биолюминесцентные и флуоресцентные методы анализа для изучения процессов in vivo и in vitro. Системы используются для детекции биолюминесценции и флуоресценции in vivo и in vitro.
Биолюминесцентная визуализация in vivo
Биолюминесценция — естественное явление излучения света живыми организмами, которое основано на взаимодействии белкового компонента (люциферазы), обладающего ферментативной функцией, молекулы субстрата (D-люциферин) и дополнительных кофакторов: O2, аденозинтрифосфат (АТФ) или ионов металлов, например, Mg2+. При окислении молекула субстрата переходит в кратковременное возбужденное состояние, а процесс релаксации сопровождается свечением широкого спектра с пиком при λ=560 нм. Важно отметить, что люцифераза может являться маркером экспрессии различных молекул в отдельных клетках или организме живых лабораторных животных. Преимущество использования биолюминесценци для вузуализации in vivo заключается в использовании фермента с высокой специфичностью к субстрату, отсутствием фонового излучения в живых тканях (автофлуоресценции), высокой эффективностью измерений сигнала, возможности обнаружения и наблюдения за малыми количествами исследуемых объектов.
Механизм реакции биолюминесценции (окисления люциферина), катализируемой
люциферазой светлячка Photinus pyralis (FLuc)
Для измерения биолюминесцентного сигнала in vitro клетки рекомендуется вносить в 96-луночный планшет в количестве 5-20×103 клеток на лунку с серией разведений 1:2. D-люциферин, растворенный в деионизованной воде, добавляется в концентрации 150 — 200 мкг/мл. Измерения необходимо проводить в динамике до тех пор, пока сигнал не выйдет на плато. Для in vivo биолюминесцентной визуализации животных рекомендуется предварительно наркотизировать внутрибрюшинной инъекцией Золетила (Vibrac, Франция) в концентрации 20 мг/мл или наркотизировать кислородной смесью с 2.5 % изофлурана. D-люциферин, растворенный в PBS, вводится внутрибрюшинно в дозе 150-200 мг/кг. Изображения можно получать через 1-3 мин после введения субстрата серийно, каждые 2 мин, в течение 20 мин. Дополнительно рекомендуется проводить анализ биолюминесценции ex vivo во всех органах cразу после умерщвления. Сигнал биолюминесценции количественно обрабатывается в программе CleVue™.
Флуоресцентная визуализация in vivo
Флюоресценция — кратковременное поглощении кванта света флюорофором (веществом, способным флуоресцировать) с последующей быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, отличные от исходного. При флюоресцентной визуализации зондирующее разрешение определенной длины волны возбуждает флуоресцентные молекулы-мишени (флуорофоры), способные в ответ испускать фотоны с большей длиной волны, которые регистрируются детектором. Флуорофоры позволяют проводить многократные короткие измерения их флуоресценции без вмешательства в изучаемый образец, но в то же время возбуждение флуоресценции создает относительно высокий фоновый сигнал, вызванный автофлуоресценцией.
Для проведения флуоресцентной визуализации in vivo на системе VISQUE™ InVivo животных рекомендуется предварительно наркотизировать внутрибрюшинной инъекцией Золетила (Vibrac, Франция) в концентрации 20 мг/мл или наркотизировать кислородной смесью с 2.5 % изофлурана. Флуоресценцию рекомендуется возбужать и детектировать сигнал согласно рекомендациям производителя флуорофоров, при экспозиции 5-8 сек. Дополнительно рекомендуется проводить анализ флуоресценции ex vivo во всех органах cразу после умерщвления. В программе CleVue™ проводится количественный анализ сигнала флуоресценции.
Общая схема и принцип работы системы визуализации VISQUE™ InVivo
Принцип работы системы визуализации для поверхностной флуоресцентной визуализации основан на регистрации флуоресценции с поверхности исследуемого объекта при облучении гомогенизированным световым пучком на нескольких длинах волн в полосе возбуждения флуоресценции. Флуоресценция регистрируется цифровой камерой с фильтрами, которые отделяют возбуждающее излучение. Время получения изображения составляет 1-15 секунд. В качестве источников излучения используются узкоспектральные светодиоды и системы сменных фильтров для регистрации флуоресценции. VISQUE™ InVivo — высокочувствительная система для неинвазивной визуализации исследуемого объекта в реальном времени. Данная система обеспечивает визуализацию в режиме как биолюминесценции, так и флуоресценции. Оптимизированный набор высокоэффективных фильтров и алгоритмов разделения спектров позволяет использовать биолюминесцентные и флуоресцентные маркеры в диапазоне длин волн от синего до ближне инфракрасного. При флуоресцентной визуализации система работает в режиме: отражения (эпилюминесценция). Источником возбуждения в обоих режимах является рассеянный свет от узкоспектральных светодиодов. Приборы снабжены узкополосными возбуждающими фильтрами в диапазоне 390 — 790 нм и узкополосными фильтрами эмиссии в диапазоне 500 — 940 нм, позволяющими значительно сократить автофлуоресценцию при использовании алгоритмов спектрального разделения.
