Использование пространственной интерференционной микроскопии (SLIM™) для томографической визуализации и 3D-анализа живых клеток. Градиентно-световая интерференционная микроскопия (GLIM™) также может быть использована для томографической визуализации более плотно упакованных образцов, таких как ткани, органоиды и эмбрионы. Для простоты, снимки, сделанные для даного приложения, сделаны с помощью интерференционного модуля системы SLIM™.
Томографию немеченных живых клеток получают, путем сканирования всего образца по оси фокуса, далее получают последовательную серию срезов изображения вдоль оси клетки. Полученная суммарная серия изображений содержит полную 3D информацию об объекте, которая может быть обработана в дальнейшем для получения информации о структуре и пространственном распределении компартментов внутри объекта. 3D рендеринг стека изображений выполняется на ImageJ для обеспечения полного описания клетки. Основываясь на количественных фазовых изображениях, возможно применения технологии SLIM™ в науке и клинике и получение результатов более высокого уровня информативности по сравнению с со стандартными методами оптической микроскопии.
Технология SLIM™ компании Phi Optics, Inc. (США) — это неинвазивная технология фазовой визуализации, которая количественно определяет физические свойства живых клеток и тканей. В результате анализа получается количественное изображение (SLIM™-карта) образца в режиме реального времени на столике микроскопа. Интенсивность каждого пикселя в кадре является мерой разности длины оптического пути (в радианах) через образец, т.е. картой фазовых сдвигов, которая измеряется с чувствительностью более 0.5 нанометров [1]. При использовании объектива с высоким значением NA, освещенность в белом свете обеспечивает исключительный оптический эффект сечения (рис. 1) по SLIM™ технологии, что позволяет получить изображение виртуального среза внутри клетки толщиной около 1 мкм [2, 3]. Исследуемый образец виртуально разрезается на тонкие слои, каждый срез последовательно визуализируется по мере того, как сканирующая система сканирует его фокус через объект. Необходимые настройки для выполнения измерения по оси z стека интегрированы в программное обеспечение CellVista™ , Phi Optics, Inc. (США), которое управляет как захватом, так и сканированием фокуса микроскопа.
Пример оптического сечения в технологии SLIM™ показан в виде сканирования фокуса через клетку U-2OS в диапазоне 13 мм (вверху). Красные и черные очерченные области увеличены для более четкого отображения возможности оптического сечения (снизу). Цветовая схема представляет значение фазы, при этом красный цвет представляет большие значения фазы, а синий — малые значения фазы.
2D-Оптическая визуализации в режиме реального времени клетки помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Результатом трехмерной визуализации с использованием SLIM™является стопка изображений, отсканированных через фокус (z-стек). Для правильного анализа 3D-данных, z-стек необходимо отрегулировать с учетом пространственного масштаба, представленного в стеке, т.е. задать размер вокселя для стека. Это можно сделать, настроив свойства стека в ImageJ. Меню “Свойства” можно найти в меню Image в главном окне ImageJ, что позволяет пользователю задать ширину, высоту и глубину. Ширина и высота — это пространственная шкала на плоскости образца, которую представляет пиксел на SLIM™-карте. Глубина — размер шага z, определяемый экспериментом.
Плагин ImageJ предоставляет несколько различных плагинов для анализа и рендеринга 3D данных, полученных с технологией SLIM™. Представлены четыре наиболее часто используемых плагина в “3D Analysis” , один плагин в разделе “2D Analysis”.
A. Плагин “3D Project”
Плагин “3D Project” позволяет провести 3D рендеринг в виде различных углов проекций вдоль вертикальной оси. Он генерирует поворот реконструируемого объекта на 360°. В результате получается стопка изображений, на каждом из которых изображена проекция объекта под углом, соответствующим изображению (Рис. 2). Режимы проекции: ближайшая точка (показывает ближайший воксел вдоль линии анализа), самая яркая точка (показывает самый яркий воксел вдоль линии анализа) и среднее значение (показывает среднее значение вокселей вдоль линии анализа). Можно определить увеличение угла, а также верхний и нижний порог прозрачности. “3D Project” также предоставляет возможность интерполяции для получения сглаженных результатов рендеринга дискретных данных. Этот плагин требует преобразования стека в 8-битный объект.
B. Плагин “3D Viewer”
Плагин “3D Viewer” строит объем из стека в 3D. В отличие от “3D Project”, пользователь может свободно вращать объем, не ограничиваясь одной осью, увеличивать или уменьшать масштаб (рис. 3). Порог прозрачности также может быть применен в меню “Edit” окна результата. Кроме того, плагин позволяет пользователю вводить несколько каналов для реконструкции, позволяя накладывать несколько режимов визуализации.Линейная зависимость между скоростью роста и массой указывает на то, что в среднем клетки E.coli демонстрируют экспоненциальное поведение роста [2].
C. Плагин “Orthogonal View”
Плагин “Orthogonal View” показывает три поперечных сечения вдоль трех репрезентативных плоскостей — x-y, y-z и x-z, взятых в указанном месте. Плагин открывает два дополнительных окна вокруг оригинального стека для представления двух ортогональных видов стека (рисунок 4). Расположение поперечного сечения обозначается желтыми линиями на изображениях, может быть выбрано простым нажатием на изображение или сканированием z стека.
Плагин “Volume Viewer”
Плагин “Volume Viewer” обеспечивает 3D рендеринг стека, а также показывает поперечные сечения вдоль плоскостей x-y, y-z, x-z. Существует несколько режимов работы: “срез”, “срез & границы”, “макс-проекция”, “проекция” и “объем”. “cрез” и “ “срез & границы” показывают один фрагмент, ортогональный к линии зрения пользователя. “макс-проекция” и “проекция” показывают один вид, который представляет собой максимальные или средние значения вдоль линии видимости. Объем 3D объекта реконструируется из данных стека, аналогично “3D viewer” (Рис. 5). Пользователь может настроить угол или прозрачность всего стека, нарисовав собственную кривую на гистограмме, расположенной в правой части окна результата.
E. Плагин “Cell Volume”
Хотя для определения объема клетки, безусловно, можно использовать трехмерную реконструкцию, технология SLIM™ предоставляет простой метод определения объема клетки при использовании низкого NA объектива. Используя способность получать данные о толщине образца, можно рассчитать объем в каждом пикселе, объединив эти объемы по площади, покрываемой клеткой, можно определить объем клетки. Компания Phi Optics, Inc. (США) также предоставляет плагин ImageJ, который рассчитывает объем клетки по фазовой SLIM™-карте, принимая за входные данные размер пиксела и показатели преломления в клетки и фона (рис. 6). Плагин можно найти в меню 2D-анализа.
Черным цветом показана сухая масса vs. время для синхронизированной популяции клеток в области исследования площадью 3,2 × 2,4 кв. мм, полученная путем монтирования изображений размеров 8 × 8, полученных при использовании микроскопа. (10× объектив, NA = 0.3). Красным цветом показано среднее значение сухой массы клетки vs. время. Изображения показывают область исследования на 4 часа (слева) и 45 часов (справа). Цветная полоса измеряется в радианах (фазовый сдвиг) [2].
Благодаря высокому разрешению SLIM™ -изображений (например, 4 мегапикселя) можно изучать большие популяции клеток. Технология SLIM™ использовалась при измерениях роста клеток млекопитающих в течение более, чем одного клеточного цикла, как показано на рисунках 5 и 6 [2]. Результаты, приведенные на рис. 7, показывают, что средняя масса клетки развивается синхронно во времени с общей массой всей популяции в течение (среднего) клеточного цикла, т.е. 22-26 ч, после чего она выравнивается. Этот вывод указывает на то, что после одного клеточного цикла культура теряет синхронность, а масса одной клетки ограничивается митозом.
Для улучшения качества и разрешения изображения, 3D-стек может быть деконволютирован с помощью функции системного распределения точек (PSF), которая может быть рассчитана или измерена с помощью небольшого шарика [2,3]. В результате подавляется свет, получаемый вне фокуса, и улучшается разрешение, что позволяет пользователю увидеть мельчайшие детали образца (Рис. 7 и Рис. 8). Деконволюция может быть выполнена с помощью плагина DeconvoluionJ в меню 3D-анализа. Ниже представлены две томограммы, полученные с помощью SLIM™ деконволюции.
На рисунке 7. Представлены результаты дифракционной томография в белом свете (WDT).
(а) Центральная рамка измерения z-стека с помощью масляного объектива ×63/1,4 NA.
(b) Результат деконволюции того же z-среза, что и в а), на котором ясно видно спиральную структуру.
с) центральный срез трехмерной визуализации деконволюционного z-слоя, который показывает, как общую цилиндрическую морфологию, так и спиральную субклеточную структуру.
(d-f) Поперечные сечения измеренного z-стека (верхний ряд) и деконволюционного z-стека (нижний ряд).
Каждая фигурная метка соответствует меткам, показанным на рис a), b) и имеет ту же шкалу, что и a), b). Шкала размеров — 2 мм. Для реконструкции требуется около 3 минут с использованием алгоритмов разреженной деконволюции, используется z-стек из 17 изображений, каждое из которых имеет 128×128 пикселей.
Описание рисунка 8.
(а) Измеренный z- срез (вверху), поперечное сечение в области, обозначенной красной рамкой (внизу слева), и увеличенное изображение области, обозначенной желтой рамкой (внизу справа), измеренное с помощью масляного объектива ×63/1,4 NA.
(b) Деконволюционный z-срез, соответствующий измерению, показанному на рис. a) (вверху), поперечное сечение в области, обозначенной красной рамкой (внизу слева), и увеличенное изображение области, обозначенной желтой рамкой (внизу справа). Сравнивая рис a) и b), можно четко увидеть улучшение разрешения.
(c) Ложно-цветная трехмерная визуализация результата деконволюции, были использовали z-стеки из 140 изображений, каждое из которых имело размер 640 × 640 пикселей. Благодаря большому размеру изображения оно разбито на 25 суб-изображений для более быстрой деконволюции. В целом процесс деконволюции занимает около часа. Шкала размеров — 5 мкм.
Публикации
[1] G. Popescu (2011) Quantitative phase imaging of cells and tissues (McGrow-Hill, New York)
[2] T. Kim, R. Zhou, M. Mir, S. D. Babacan, P. S. Carney, L. L. Goddard and G. Popescu, Nature Photonics, 8, 256-263 (2014)
[3] M. Mir, S. D. Babacan, M. Bednarz, M. N. Do, I. Golding and G. Popescu, PLoS ONE, 7 (6), e38916 (2012)
Использование пространственно-световой интерференционной микроскопии (spatial light interference microscopy, SLIM™) возможно для измерения сухой массы многих отдельных клеток при различных условиях на пространственных шкалах от микрометров до миллиметров, временных шкалах от секунд до дней и типах клеток, от бактерий до клеток млекопитающих. Сочетание технологии SLIM™с флуоресцентной визуализацией обеспечивает уникальный метод изучения роста клеток в зависимости от их цикла: флуоресцентный репортер указывает стадию роста клеток, а технология SLIM обеспечивает неинвазивные измерения сухой массы клеток с одноклеточным разрешением и фемтограмной чувствительностью. Это позволяет использовать технологию в онкология, биология развития и тестировании безопасности лекарств.
Технология SLIM™- это не инвазивный метод количественно-фазовой визуализации, который количественно определяет физические свойства живых клеток и тканей. В результате анализа данных получается количественное изображение (SLIM™-карта) образца в режиме реального времени. Интенсивность каждого пикселя в кадре является мерой карты фазового сдвига (в радианах) или разности длин оптического пути (в нанометрах) через образец, которая измеряется с чувствительностью более 0.5 нанометров [1]. Как показано на рис. 1, карта фазового сдвига конвертируется без задержки по времени в другие SLIM™-карты с соответствующей интенсивностью пикселей: толщиной (в микронах), плотностью сухой массы (пикограммы на квадратный микрон) и индексом преломления.
Измеренная информация о длине пути в каждом пикселе напрямую связана с плотностью сухой массы в этой точке, путем суммирования данных по интересующей области (ROI), измеряется общая сухая масса в ROI. См. рис. 2. При определении сухой массы чувствительность SLIM™ соответствует фемтограмным изменениям. [2]. Компания Phi Optics Inc., США предоставляет набор плагинов на основе ImageJ (NIH, США) для дальнейшей обработки изображений; анализ может быть выполнен на любом из двух типов, полученных SLIM™-карт.
Алгоритм измерения сухой массы клетки:
Технология SLIM™ была использована для измерения сухой массы отдельных клеток E-coli, как показано на рисунке 3. Измерения проводились одновременно на отдельных клетках, и соответствующая статистика была получена на больших популяциях.
Измерение сухой массы клетки в режиме реального времени клеток при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
SLIM™ измерения роста E. coli. (А) Сухая масса vs. времени для семейства клеток. Кривые роста для каждой клетки обозначаются цветными кружками на изображениях. На снимках показаны карты плотности сухой массы одной клетки в указанные моменты времени (в минутах). (Масштаб: 2 мкм.) Синяя линия — фиксированное измерение ячеек с SD 19,6 19.6 фемтограмм. Маркеры отображают необработанные данные, сплошные линии — усредненные данные. (B) Скорость роста vs. массы 20 клеток измеряется таким же образом. Слабые круги указывают на отдельные точки данных из отдельных кривых роста клеток, темные квадраты показывают среднее значение, а пунктирная линия — линейное соответствие усредненным данным; наклон этой линии, 0,011 мин-1, является мерой средней константы роста для данной популяции. Линейная зависимость между скоростью роста и массой указывает на то, что в среднем клетки E.coli демонстрируют экспоненциальное поведение роста [2].
Для изучения роста одиночных клеток в асинхронной культуре и получения информации о росте, зависящем от цикла клеток, технологию SLIM™ использовали вместе с эпифлуоресцентной визуализацией, как показано на рис. 4 [2]. В то время как по технологии SLIM измерялась сухая масс в каждый момент времени, флуоресцентные маркеры указывали на фазу клетки в пределах клеточного цикла. Технология SLIM™ использует в микроскопе один и тот же оптический путь, что другими каналы, это обеспечивает бесшовное наложение всех обычных модальностей микроскопа.
Соответствие один к одному между клетками на изображениях SLIM™ и клетками на флуоресцентных изображениях позволяет проводить зависящие от цикла измерения роста. Сухие карты плотности массы (А) одной клетки U2OS на протяжении всего ее цикла в указанное время. (Масштаб: 25 мкм) Цветная линейка — плотность сухой массы в пг/мкм2. (В) Одновременное получение флуоресцентных изображений GFP, указывающих на активность PCNA; отчетливый сигнал GFP во время S-фазы и морфологические изменения во время митоза позволяют определить фазу цикла клетки. (С) Сухая масса vs время для семейства клеток (т. е. клетки 1->2->4). Две различные линии дочерних клеток дифференцируются по заполненным и открытым маркерам; для наглядности показана только одна дочерняя клетка от каждого родителя. Различные цвета указывают на цикл клетки, о котором сообщает флуоресценция GFP-PCNA. Черная пунктирная линия показывает измерения от неподвижной клетки, SD которой составляет 1,02 пг [2].
Результаты наложения сигнала флуоресценции на данные , полученные при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Черным цветом показана сухая масса vs. время для синхронизированной популяции клеток в области исследования площадью 3,2 × 2,4 кв. мм, полученная путем монтирования изображений размеров 8 × 8, полученных при использовании микроскопа. (10× объектив, NA = 0.3). Красным цветом показано среднее значение сухой массы клетки vs. время. Изображения показывают область исследования на 4 часа (слева) и 45 часов (справа). Цветная полоса измеряется в радианах (фазовый сдвиг) [2].
Благодаря высокому разрешению SLIM™ -изображений (например, 4 мегапикселя) можно изучать большие популяции клеток. Технология SLIM™ использовалась при измерениях роста клеток млекопитающих в течение более, чем одного клеточного цикла, как показано на рисунках 5 и 6 [2]. Результаты, приведенные на рис. 7, показывают, что средняя масса клетки развивается синхронно во времени с общей массой всей популяции в течение (среднего) клеточного цикла, т.е. 22-26 ч, после чего она выравнивается. Этот вывод указывает на то, что после одного клеточного цикла культура теряет синхронность, а масса одной клетки ограничивается митозом.
В заключение, представленные здесь результаты показывают, что технология SLIM™ предоставляет ряд достижений в отношении существующих методов количественного определения роста клеток:
(1) можно одновременно проводить параллельные измерения роста на отдельных клеток;
(2) пространственно-временные корреляции, такие как взаимодействие клеток, могут быть проведены на больших маштабах;
(3) в комбинации с флуоресценцией могут быть одновременно исследованы специфические химические процессы;
(4) проведение исследований возможно непосредственно в культуральной среде;
(5) визуализирующий характер технологии SLIM™ дает возможность непосредственно наблюдать за клетками и их окружением, выясняя природу любых артефактов и предоставляя одновременно морфологическую информацию;
(6) возможно изучение родословной;
(7) возможно наблюдение за делением клеток и проведение анализа вновь образованных клеток;
(8) возможно проведение измерений в клетках бактерий и клетках млекопитающих.
2D-Оптическая визуализация в режиме реального времени бактерий при помощи технологии SLIM™, GLIM™ (видео презентация).
Публикации
[1] G. Popescu (2011) Quantitative phase imaging of cells and tissues (McGraw-Hill, New York) p. 313.
[2] M. Mir, Z. Wang, Z. Shen, M. Bednarz, R. Bashir, I. Golding, S. Prasanth and G.Popescu, Optical Measurement of cycle-dependent growth , Proc. Natl. Acad. Sci., 108 (32), 13124 (2011).
[3] M. Mir, T. Kim, A. Majumder, M. Xiang, R. Wang, S. C. Liu, M. U. Gillette, S. Stice and G. Popescu, Label-free characterization of emerging human neuronal networks, Scientific Reports, 4, 4434 (2014)
[4] M. Mir, A. Bergamaschi, B. S. Katzenellenbogen and G. Popescu, Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response, PLoS ONE, 9 (2), e89000 (2014)
Использование пространственно-световой интерференционной микроскопии (spatial light interference microscopy, SLIM™) для изучения внутриклеточной и межклеточной динамики путем отслеживания движения малых органелл или анализа интересующей области в целом. Субнанометровая чувствительность и дифракционное ограниченное разрешение технологии SLIM™ обеспечивают идеальные средства для изучения динамики клеток. Количественные данные дают фактическую информацию о массовом транспорте с точки зрения коэффициентов диффузии и распределения скоростей. Это имеет явное применение в фундаментальных биологических науках, при изучении функции клеток, в клинических исследованиях при тестировании лекарств.
Технология SLIM™- это не инвазивный метод количественно-фазовой визуализации, который количественно определяет физические свойства живых клеток и тканей. В результате анализа данных получается количественное изображение (SLIM™-карта) образца в режиме реального времени. Интенсивность каждого пикселя в кадре является мерой карты фазового сдвига (в радианах) или разности длин оптического пути (в нанометрах) через образец, которая измеряется с чувствительностью более 0.5 нанометров [1]. Как показано на рис. 1, карта фазового сдвига конвертируется без задержки по времени в другие SLIM™-карты с соответствующей интенсивностью пикселей: толщиной (в микронах), плотностью сухой массы (пикограммы на квадратный микрон) и индексом преломления.
Результаты 2D-визуализации костных эпителиальных клеток остеосаркомы человека (U-2 OS) в режиме реального времени при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Изображения, полученные по технологии SLIM™, показывают расположение маленьких органелл внутри клетки. Эти плотные отложения белка, имеющие высокую сухую массу, могут быть легко обнаружены и отслежены с помощью измерения по времени [2]. Для анализа изображений Phi Optics, Inc. (США) предоставляет набор плагинов на основе программ ImageJ (NIH) и “Particle Tracker” Sbalzarini, Koumoutsakos [3].
Отслеживание частиц может быть настроено и выполнено с помощью плагина “Particle Tracker”. Методология по использованию плагина:
После завершения процесса обнаружение частиц, появляется рабочее окно с различными опциями для отображения результата.
Технология SLIM™ использовалась для отслеживания движений органелл в бьющейся клетке сердца [2]. Слежение за органеллами позволило измерить коэффициент диффузии. Малый коэффициент диффузии указывает на то, что движение органелл ограничено размерами клетки (рис. 4).
Межклеточный транспорт также изучали с помощью SLIM™, на примере анализа транспорта между нейронами [2]. Вычислен коэффициент диффузии в горизонтальном и вертикальном направлениях. Поскольку нейроны в основном расширяются по горизонтали в пределах поля зрения, пространственное ограничение вдоль вертикали привела к очень малому коэффициенту диффузии вдоль вертикали (рис. 5).
На рисунке 5 показано, каким образом SLIM™технология осуществляет мониторинг транспорта частиц в гиппокампальной нейронной сети. Объектив ZEISS Plan-Neofluar 40X/0.75. a) карта фаз нейронной сети. Стрелками с 1 по 5 показаны временные трассы соответствующих точек вдоль пунктирной линии. Вся область исследования составляет 100 мкм×75 мкм. Используется объектив Zeiss Plan-Neofluar 40×/0.75. (b) Оптическая длина пути изменяется во времени для пяти точек, указанных в (а). Пики в точечных трассах соответствуют фазовым сдвигам, связанным с (быстрым) движением органелл. c) Лаплациан выбранного района, указанного в a). Шкала — 5 мкм. (d) Фазовая карта той же области, что и в (c), при этом некоторые следы частиц показаны мелкими линиями. (e) График MSD для 70 отдельных частиц в (d). Поскольку частицы ограничены в направлении Y, коэффициент диффузии для этого направления на 2 порядка меньше, чем для другого направления. На вставке показаны две оси Y, одни и те же кривые MSD в линейном представлении. [2]
Технология SLIM™ позволяет изучать клеточную динамику даже в тех случаях, когда динамические структуры являются непрерывными и не могут быть отслежены как частицы. DPS — это метод анализа SLIM™-изображений с временными интервалами. DPS обеспечивает связь между пространственными и временными флуктуациями на образце и дает информацию о коэффициенте диффузии, распределении скоростей, а также о способе переноса: случайном или детерминированном.
Загрузите временную последовательность SLIM™ для анализа DPS 2. Запустите плагин DPS в меню “Dynamics” 3. Настройте параметры (шаг времени и размер пикселя), выберите квадратную форму области интереса (ROI) для анализа и запустите плагин. 4. В результате появится карта DPS и график DPS (рис. 6). 5. Коэффициенты диффузии и распределения скоростей можно рассчитать на основании графика DPS.
Технология DPS применяется к различным клеткам, в том числе к глиям, микроглиям и нейронам, для установления межклеточного и внутриклеточного транспорта этих клеток [4]. На (рис. 7) представлена информация о коэффициенте диффузии, скорости адвекции и способе транспорта.
На рис. 7 показан количественный фазовый образ культуры глии (a, g), микроглии (c) и гиппокампальных нейронов (e). (б) Дисперсионная кривая измеряется для клетки в а. Зеленая и красная линии указывают на направленное движение и диффузию, соответственно. Вставка показывает (qx, qy) карты. (d, f, h) Дисперсионные кривые (q), связанные с областями белого: с), е) и g), соответственно. Указываются соответствующие результирующие значения D и v. [4]
Результаты 2D-визуализации глии в режиме реального времени при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Публикации
[1] G. Popescu (2011) Quantitative phase imaging of cells and tissues (McGrow-Hill, New York)
[2] Z. Wang, L. Millet, V. Chan, H. Ding, M. U. Gillette, R. Bashir, and G.Popescu, Label-free intracellular trans- port measured by spatial light interference microscopy, J. Biomed. Opt., 16(2), 026019 (2011).
[3] I. F. Sbalzarini and P. Koumoutsakos. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J. Struct. Biol., 151(2): 182–195, 2005
[4] R.Wang, Z. Wang, L. Millet, M. U. Gillette, A.J. Levine, and G.Popescu, Dispersion-relation phase spectros- copy of intracellular transport, Opt. Exp. 19(21), 20571 (2011).
Использование пространственно-световой интерференционной микроскопии (spatial light interference microscopy, SLIM™) для исследования нейронов. Не инвазивная визуализация живых клеток обеспечивает жизнеспособную среду для хрупких нейронов и нейронных стволовых клеток, которые очень восприимчивы к повреждениям, вызванным температурой, химическими веществами и светом. Скорость получения данных по технологии SLIM™ позволяет обнаружить транспорт между нейронами, а широкое поле зрения (область исследований) позволяет визуализировать формирование нейронной сети. Технология SLIM™ позволяет изучать нейроны, как на уровне отдельных клеток, так и на уровне популяции.
Технология SLIM™- это не инвазивный метод количественно-фазовой визуализации, который количественно определяет физические свойства живых клеток и тканей. В результате анализа данных получается количественное изображение (SLIM™-карта) образца в режиме реального времени. Интенсивность каждого пикселя в кадре является мерой карты фазового сдвига (в радианах) или разности длин оптического пути (в нанометрах) через образец, которая измеряется с чувствительностью более 0.5 нанометров [1]. Как показано на рис. 1, карта фазового сдвига конвертируется без задержки по времени в другие SLIM™-карты с соответствующей интенсивностью пикселей: толщиной (в микронах), плотностью сухой массы (пикограммы на квадратный микрон) и индексом преломления.
NeuronJ — это плагин ImageJ, разработанный компанией Meijering и др. [2]. Плагин можно найти в меню “2D analysis”, а после запуска — загрузить новый инструментарий в главном окне ImageJ. NeuronJ позволяет пользователю легко проводить трассировку вдоль нейритов и выполнять измерения таких параметров, как длина, среднее значение вдоль “трассы” и многое другое. Кроме того, “трассы” могут быть сохранены в виде текста, состоящего из координат и значений точек вдоль “трассы”, что позволяет пользователю рассматривать данные, как список значений, а не как сложную структуру.
Быстрые обмены материалом между нейронами возникает в виде везикулового переноса вдоль нейронов, связывающих соседние нейроны. Везикулы имеют более высокую плотность по сравнению с нейронами и появляются в виде частицы, движущейся вдоль нейронов. Поэтому, применяя метод слежения за частицами, можно отслеживать движение везикул и изучать транспорт или «движение» вдоль нейронного “шоссе” (рис. 3) [3]. Подробнее о слежении за частицами см. раздел “Клеточная динамика”
На рисунке 3 показано построение фазовой карты нейритов во времени. а) фазовая карта нейронной сети. Стрелками с 1 по 5 показаны временные трассы соответствующих точек вдоль пунктирной линии. Вся область исследования составляет 100 мкм×75 мкм. Используется объектив Zeiss Plan-Neofluar 40×/0.75. b) изменение длины оптического пути во времени для пяти точек, указанных в пункте, а). Пики в точечных трассах соответствуют фазовым сдвигам, связанным с (быстрым) движением органел. c) Лаплациан выбранного района, указанного в подпункте a). Шкала — 5 мкм. (d) Фазовая карта той же области, что и в (c), при этом некоторые следы частиц показаны мелкими линиями. (e) График журнала MSD для 70 отдельных частиц в (d). Поскольку частицы ограничены в направлении Y, коэффициент диффузии для этого направления на 2 порядка меньше, чем для другого направления. На вставке показаны одни и те же кривые MSD в линейном представлении и две оси Y.
Поскольку нейроны очень хрупки и уязвимы для многих инвазивных факторов, таких как химические вещества, свет и тепло, то изучение роста клеток затруднено. Технология SLIM™ позволяет провести исследование методом оптической визуализации с контролированием в ходе эксперимента температуру, CO2, а также подвергая клетки минимальному повреждению светом. Рост нейронов изучен и показано появление нейронной сети помощью технологии SLIM™ (рис. 4) [4].
Рисунок 4 иллюстрирует рост сухой массы с течением времени и влияние ингибитора роста, хлористого лития (LiCl) (A) Карты плотности сухой массы, полученные при 0, 10 и 24 часах, как для необработанных культур, так и для культур, обработанных LiCl; желтая шкала соответствует 200 мкм. (В) Общая сухая масса vs время во всей области исследований для обоих условий. Круглые маркеры – необработанные данные массы, сплошные линии — среднее значение за 1 час, столбики ошибок указывают на стандартное отклонение. Для необработанной культуры видно, что большая часть роста массы происходит в промежутке от 0 до 10 часов — времени, в течение которого клетки наиболее активно развиваются. В обработанной LiCl культуре отростки нейрита сильно заторможены, и никакого значительного увеличения массы в течение, какого-либо периода времени не наблюдается.
Неинвазивная среда, которую SLIM™ технология обеспечивает, подходит для изучения не только зрелых клеток нейронов, но и клеток-предшественников, которые даже более хрупкие, чем зрелые нейроны. С помощью технологии SLIM™ могут быть легко изучены: структурные изменения клеток нейронов-предшественников, изменения в динамике, развитие зрелых клеток от клеток-предшественников. В ходе исследования клетки не подвергаются деструктивному воздействию. (рис. 5).
2D-Оптическая визуализация в режиме реального времени нейронов при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Публикации
[1] G. Popescu (2011) Quantitative phase imaging of cells and tissues (McGrow-Hill, New York)
[2] E. Meijering, M. Jacob, J.-C. F. Sarria, P. Steiner, H. Hirling and M. Unser, Design and validation tool for neurite tracing and analysis in uorescence microscopy images, Cytometry Part A, 58 (2), 167-176 (2004)
[3] Z. Wang, L. Millet, V. Chan, H. Ding, M. U. Gillette, R. Bashir and G. Popescu, Label-free intracellular trans- port measured by spatial light interference microscopy, Journal of Biomedical Optics, 16 (2), 026019 (2011)
[4] M. Mir, T. Kim, A. Majumder, M. Xiang, R. Wang, S. C. Liu, M. U. Gillette, S. Stice and G. Popescu, Label-free characterization of emerging human neuronal networks, Scienti c Reports, 4, 4434 (2014)
Возможность использование интерференционной микроскопии (SLIM™) для визуализации и диагностики срезов тканей. SLIM™ позволяет автоматически сканировать и визуализировать слайды микроскопии с образцами тканей. Количественные данные, полученные с помощью технологии SLIM™, позволяют получить представление о состоянии тканей без окрашивания, при изучении доброкачественных и злокачественных состояний, что позволяет автоматически диагностировать рак в образце ткани. Более того, фазовая томография выявляет определенные структуры, которые нелегко обнаружить при помощи простых методов окрашивания, что является современным стандартом в клиниках, который может быть использован в качестве более простого и быстрого индикатора для диагностики состояния.
Определение количества коллагеновых волокон в срезах злокачественной опухоли железистой ткани молочной железы без окрашивания при помощи технологии SLIM™ (видео презентация).
Технология SLIM™ — это неинвазивная технология фазовой визуализации, которая количественно определяет физические свойства живых клеток и тканей. В результате обработки изображений получаются количественные данные, которые формируют изображение (SLIM™-карта) образца на столике микроскопа. Интенсивность каждого пикселя в кадре — это мера разности длины оптического пути (в радианах) через образец, т.е. карта фазовых сдвигов, которая измеряется с точностью до 0,5 нм. (Рис 1) [1].
Технологии SLIM™ может автоматически сканировать предметный слайд с биопсией тканей с высоким разрешением, это позволяет проводить автоматическое сканирование тканей и осуществлять диагностику [2]. Размер каждого кадра зависит от объектива и детектора.
Алгоритм сканирования образца ткани:
Программное обеспечение «CellVista», Phi Optics, Inc. (США) делает сканирование тканей простым и быстрым, интегрируя управление микроскопом и получение изображений. Коррекция фокусировки, реализованная в программном обеспечении, удерживает образец в фокусе, в то время, как система сканирования изображений сканирует и получает изображения на большой площади.
Мозаичность
Соединение изображений в единый образ, полученный при помощи программного обеспечения “CellVista” может происходить при использовании плагина ImageJ, написанного Preibisch et al. [3]. Данный плагин включен в программу ImageJ на панели “ Stitching menu”. Для соединения изображений тканей, полученных по технологии SLIM™, которые обычно включают большое количество изображений рекомендуется использовать функцию “Stitch Grid of Images”.
Количественные данные, полученные при помощи технологии SLIM™ , могут быть использованы в качестве маркера для диагностики рака (рис. 4). Длина оптического пути, измеренная для структур, таких как строма или эритроциты, присутствующих в биопсии ткани, различна для различных структур, значение может быть использована в качестве маркера для исследуемых структур. Более того, некоторые значимые и индикативные структуры, не поддающиеся детектированию путем окрашивания, такие как микрокальцинация при гистологическом окрашивании (гематоксилин-эозином) (рис. 5) [4], могут быть обнаружены SLIM™ технологий (рис. 5). Совсем недавно проведенная патологоанатомами диагностика на основе SLIM™-карт показала высокую корреляцию с диагнозом на окрашенных биопсиях гематоксилином-эозином [5].
Описание рисунка 4. Подписи для визуализации данных SLIM™. Красные кровяные тельца: SLIM™
(a) и окрашенные гематоксилином-эозином
(b). Красные кровяные тельца могут быть идентифицированы по их уникальной форме. Шкала: 20 мкм. Лимфоциты с SLIM™
(c) и окрашенные гематоксилином-эозином
(d). Лимфоциты были подтверждены окрашиванием CD45. Стромальные клетки с SLIM™ (e) и окрашенные гематоксилином-эозином
(f). g) длина оптического пути для трех различных клеток, характеризующихся высоким индексом преломления. Масштабная линейка: 100 мкм. Цветная полоса указывает длину оптического пути в нанометрах.
Описание к рисунку 5. SLIM™-изображение микрокальцификации груди. Ткань груди с фосфатом кальция: Изображение SLIM™
(а), цветовая шкала в нанометрах; изображение, окрашенное гематоксилином-эозином
(b). Весь срез 2,2 см × 2,4 см. Изображение SLIM получено путем соединения 4785 изображений, а изображение, прокрашенного образца гематоксилином-эозином получено путем соединения – 925 изображений. Масштаб: 100 мкм. Ткань груди с оксалатом кальция: Изображение SLIM™
(c), цветовая шкала в нанометрах; изображение, окрашенное гематоксилином-эозином
(d). Весь срез 1. 6 см × 2,4 см. Изображение SLIM™ получено путем соединения 2840 изображений, а изображение, окрашенное гематоксилином-эозином, получено путем соединения – 576 изображений. Масштаб: 200 мкм.
Технология SLIM™, визуализируя фазовый сдвиг, может реконструировать световое поле, рассеянное образцом ткани (рис. 6). Поэтому, такие параметры рассеяния, как средний свободный путь (ls) и анизотропия (g), могут быть рассчитаны по SLIM™-картам [6]. Эти параметры использовались для прогнозирования рецидивов рака предстательной железы и превосходили некоторые широко распространенные клинические инструменты, такие как CAPRA-S (рис. 7) [2].
Описание к рисунку 7. Отдельные слои стромы, непосредственно прилегающие к железам 12-16, были выделены на снимках SLIM™ у каждого из 92 рецидивирующих и 89 не рецидивирующих пациентов, которым была сделана простатэктомия. Пациенты двух групп были сопоставлены по возрасту на стадии простатэктомии, уровню Глисона и клинической стадии. Параметр оптической анизотропии рассчитывался для каждой области, как это описано в Материалах и Методиках. Данный параметр отделяет случаи рецидива от единовременных близнецов с АУК (площадь под кривой) 0,72, как показано на рисунке. Более низкие значения этого показателя соответствуют большей вероятности биохимического повторения. Используя значение отсечения g=0,938, можно предсказать повторение с чувствительностью 77% и специфичностью 62%.
Показатели CAPRA-S, соответствующие 161 пациенту, 83 рецидивирующим и 78 не рецидивирующим, показали слабую дискриминацию (АУК (площадь под кривой) 0,54). Двадцать случаев были исключены из анализа CAPRA-S в связи с одним или несколькими отсутствующими параметрами для расчета CAPRA-S.
Публикации
Использование новой методики количественной фазовой визуализации (QPI), которая называется пространственно-световой интерференционной микроскопией (spatial light interference microscopy, SLIM™), для обеспечения быстрых и точных количественных измерений растворов белковых частиц. SLIM™ это метод широкополосной визуализации, не требующий использования биомаркеров. Это позволяет проводить более быстрые неразрушающие анализы для мониторинга производства, характеристики и агрегации белков. Также возможна сегментация и классификация силиконовых примесей.
Интерференционные QPI, SLIM™ модули Phi Optics, Inc. (США) подключаются к инвертированным оптическим микроскопам через доступный боковой порт C-Mount. SLIM™работает с установленным фазовым контрастным микроскопом. Программное обеспечение CellVista напрямую взаимодействует с микроскопом для управления всеми функциями при включении QPI-режима SLIM, что позволяет получать данные об анализах для производства белка, характеристики и агрегации частиц без использования технологий мечения.
Технология SLIM™ высокую контрастность и количественные данные с единичным субмикронным разрешением частиц в диапазоне от 200 нм до 100 мкм. Трехмерное сканирование (XYZ) возможно провести в любой плоскодонной стеклянной чашке или много луночном планшете, технология обеспечивает высокую пропускную способность (до 100 мкл/мин), без перекрестного загрязнения.
Технология SLIM™хорошо работает при проведении анализа клеток и белков. При помощи технологии SLIM™можно контролировать форму, структуру и процессы с нанометрической чувствительностью (по оси Z), обеспечивая количественную оценку содержания белков с фемтограмной чувствительность. SLIM™не имеет ограничения в минимальных размерах, что позволяет исследователям работать с небольшими партиями образцов. Образцы могут быть визуализированы в стеклянных чашках Петри или многолуночных планшетах, посредством прямого забора из биореактора, где отсутствует перенос частиц, перекрестные загрязнения, промывки, а также утечки или засорения.
Технология SLIM™также может быть интегрирована в настольный прибор (с использованием одноразовой проточной камеры) для поточного мониторинга культур биореакторов.
Программное обеспечение “CellVista Pro” обеспечивает программируемый сбор данных для 2D (мозаичность), 3D (z-стек) и 4D изображений (3D + серии изображений во временных интервалах) с использованием SLIM™и любого количества каналов, присутствующих на микроскопе (например, флуоресценции).
Полученные в результате съемки изображения, сформированные в SLIM™-карты можно сегментировать с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений. В примере показана процедура с использованием бесплатной программы ImageJ (NIH, DOI: 10.1038/nmeth.2089).
Полученная информация о длине пути в каждом пикселе связана с плотностью сухой массы в этой точке. Путем суммирования данных по интересующей области (ROI), измеряется общая сухая масса в ROI. При преобразовании в сухую массу чувствительность SLIM™соответствует изменениям порядка нескольких фемтограм.
Алгоритм подсчета частиц и измерение сухой массы при помощи плагина ImageJ:
Показатели
Возможности технологии SLIM™включают в себя процесс сегментацию, подсчет частиц, трехмерную объемную морфологию и отслеживание, содержание белка (пикограммы) и индекс преломления ID в режиме реального времени. Данные выдаются в формате Excel: Плотность клеток, жизнеспособность клеток и содержание белков. Данные полностью воспроизводятся, образцы инвариантны и подходят для приложений с использованием машинного обучения.
Количественные данные доступны для отдельной частицы или для целой популяции (размер частиц 0,01 — 100 мкм). Приборы способны измерять высокую плотность и обеспечивать высокую пропускную способность (количество частиц 6 x 1010 частиц/мл.).
Применения
Использование технологии SLIM™ для поведения исследований частиц и белковых агрегатов (видео презентация).
Задать вопрос по технологиям и оборудованию можно по телефону +7-495-922-2564, по почте info@invivotech.ru или заполнить электронную форму на сайте.
