Технология для культивирования клеток и продуцентов FiberCell Systems™

На сегодняшний день применение технологии FiberCell Systems™ для культивирования продуцентов является оптимальным решением по сравнению с традиционными подходами выращивания культур с использованием шейкеров-инкубаторов или ферментативных реакторов.

Системы культивирования Hollow Fiber Cell Culture Systems™, FiberCell Systems Inc. (США) позволяет экономить лабораторное пространство, увеличить количество клеток и концентрацию секретируемого продукта c заданной молекулярной массой, уменьшить расход культуральной среды, облегчить работу с клетками, приблизить условия эксперимента к in-vivo процессам.

Система Hollow Fiber Cell Culture Systems™, FiberCell Systems Inc. (США) может применяться в научных и в коммерческих лабораториях для производства моноклональных антител, белков, экзосом, вирусов, кондиционированных сред, секретомов клеток, моделей cо-культивирования, культивирование клеток внутри волокон в потоке, создания 3D моделей in vitro для долгосрочных исследований.

Подробнее ознакомиться с физическими характеристиками картриджа можно в брошюре.

Общая схема процесса культивирования клеток и получения продуцента в системе полого волокна FiberCell Systems™.

Картридж (FiberCell Systems, Inc.)

Картриджи систем Fibercell заполнены волокнами (Hollow fibers) – микрофильтрами с полой структурой. Волокна имеют различные диаметры пор для диффузии молекул с молекулярной массой 5кДа, 20 кДа и более. Культуральная среда прокачивается через волокна и обеспечивает рост клеток в ограниченном пространстве на поверхности волокон. Волокна создают полупроницаемый барьер с заданными свойствами между пространством, где культивируются клетки, и протекающей средой. В процессе секретирования продукты концентрируются в малых объемах межволоконного пространства, где их концентрация может достигать значений в 100 раз больших, чем при проведении аналогичного процесса в колбах или в роллерных бутылях. Упаковка волокон внутри картриджа создает огромную площадь поверхности в очень малом объеме.

Картридж из полого волокна FiberCell Systems™ является стерильным устройством однократного применения с рабочим объемом (3 мл., 20 мл., 70 мл.), MWCO (5 кДа, 20 кДа). Также есть картридж для эндотелиальных клеток MWCO (0,1 мкм).

Принципиальная схема Hollow Fiber Cell Culture Systems™, FiberCell Systems Inc., с системой подачи жидкости

Фрагмент картриджа Hollow Fibers системы FiberCell в разрезе, демонстрирующий высокую плотность роста клеток в межволоконном пространстве.

Схема биореактора на полых волокнах. Циркулирование
питательной среды предполагается внутри полых волокон, клетки
располагаются снаружи полых волокон.

Общая схема процессов, протекающие в окружности 3-х полых волокон картриджа Hollow Fibers системы FiberCell, при росте клеток в условиях высокой плотности биомассы.

Волокна в картридже могут быть из полисульфона, целлюлозы и модифицированного полисульфона, что позволяет проводить разделение белков по молекулярной массе не менее 5 кД, 20 кД и 0.1 микрон. Физические характеристики картриджа приведены в таблице.

Картридж с волокнами из полисульфона

Гидрофильное полисульфоновое волокно c MWCO (5 кДа , 20 кДа) имеет высокую скорость фильтрации в ходе процесса обмена питательными веществами и отведением продуктов деятельности клеток. Любой тип клеток, которые будут прикрепляться к пластику или расти в культуре суспензий, будет хорошо расти в полисульфонном картридже.

Картридж с волокнами из целлюлозы

Не рекомендуется использовать для клеточных культур млекопитающих, подходят для использования в исследованиях антибиотиков по PK/PD критериям.

Картридж с активированным волокном 0,1 мкм

После обработки матриксом данный тип волокон может связывать белковые матрицы антитела, цитокины. Используется для первичных типов клеток, где необходимо контролировать поверхность матрикса, на которой взаимодействуют клетки, а также для роста эндотелиальных клеток на внутренней стороне волокна.

Отсечение по молекулярной массе (MWCO)

Отсечение по молекулярной массе (MWCO) для картриджей FiberCell Systems – это молекулярная масса молекулы, у которой есть 50%-отклонение мембраной. «Полезная ретенция» — это размер белка, который будет задерживаться мембраной при >=90%. Задержание белка зависит от молекулярной массы, размера, формы, посттрансляционных модификаций и гидродинамического радиуса. Для волокна MWCO (5 кДа) полезный размер ретенции > =20 кДа, картриджи с данным типом волокна надо использовать для белков с MW от 20 кДа до 140 кДа. Для более крупных белков следует использовать картриджи с волокном MWCO (20 кДа).

Размер картриджа

Например, несмотря на небольшой рабочий объем (20 мл) картридж (C2011) FiberCell Systems имеет площадь поверхности более 4000 см² (см. таблицу), что позволяет получить большее количество биомассы или продуцента, чем при использовании биореактора с 10 литровым мешком. Картриджи с большим рабочим объёмом рекомендуется использовать для получения более 500 мг рекомбинантного белка.

Портативный насос (Duet™ FiberCell Systems, Inc.)

Насос обеспечивает постоянное циркулирование жидкости, позволяет проводить плавное изменения параметров потока и оксигинации культуральной среды. Скорость потока может варьироваться от 1 мл в минуту до 220 мл в минуту в зависимости от используемого картриджа. Возможно одновременное использование двух разных картриджей на 20 мл и на 70 мл (5 кДа, 20 кДа соответственно). Насос с установленной системой Fiber cells можно поставить на полку стандартного 180-литрового CO₂-инкубатора. Насос не требует подключения компьютера и не связан с источниками O₂, CO₂. Обеспечение температуры и подача газ обеспечивается CO₂-инкубатором. Насос имеет плоское сечение шнура электропитания для проводки через герметично закрытую дверь CO₂-инкубатора.

Портативный насос Duet™ для системы FiberCell Systems.

Подробнее ознакомиться с техническими характеристиками насоса можно в инструкции пользователя.

Технические и физические характеристики портативного насоса

Диапазон рабочих температур:	5°C — 40°C
Максимальная относительная влажность воздуха	не должна превышать 50% и 90% при 20°C
Температура хранения/транспортировки	в диапазоне от -25°C до +55°C, в течении короткого периода времени (24 часа) до +70°C
Высота над уровнем моря	до 1000 метров.
Токовая нагрузка	500 мА, 24 Вольт
Электрический ток	100/120/220 вольт 50/60 Гц , универсальный источник питания
	Запрещается автоклавировать, опускать в жидкость
Очистка поверхностей	производится раствором 70% этанола
Размеры	23 см X 43 см X 18 см
Вес	4,2 кг
Пиковое С-взвешенное мгновенное звуковое давление	не превышает 63 Па
A-взвешенный уровень звуковой мощности	не превышает 80 Дб (A).
	Не содержит источником ионизирующего излучения
Внешний управляющий блок	регулирование скорости потока
	магнитное крепление
	плоское сечение шнура электропитания для использования насоса внутри СО₂-инкубатора

Краткая видео презентация по подключению и установке насоса в CO₂-инкубатор.

Крышка для культурального флакона (FiberCell Systems, Inc.)

Винтовая крышка, с силиконовой вставкой и стальными отводящими трубками со стандартными люэровскими соединениями с входной стороны, используется для подачи культуральной среды из флакона и сохранения стерильности в ходе замкнутого цикла выращивания культуры. Крышка изготовлена из полисульфона, что позволяет после работы с различными продуцентами. проводить стерилизацию методом автоклавирования. Крышка поставляется для флаконов с диаметром центрального горлышка: 33 мм, 38 мм, 45 мм.

Крышка культурального флакона со встроенными стальными трубками, имеющими винтовое соединение типа Люэр. для отвода культуральной среды.

Собранная система Hollow Fiber Cell Culture Systems™, FiberCell Systems Inc. в стерильной зоне ламинарного шкафа.

Сухая питательная смесь (CDM-HD™ FiberCell Systems, Inc.)

Сухая питательная смесь CDM-HD представляет собой специальный химический состав, не содержащий белков. CDM-HD дает возможность эффективно применять любые среды, такие как DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) и другие, широко используемые для культивирования бактериальных клеток и клеток млекопитающих, не требуя применения сыворотки. CDM-HD специально оптимизирована для выращивания культур в условиях высокой плотности клеток в картриджах FiberCell Systems. CDM-HD характеризуется высокой степенью однородности от лота к лоту, облегчает очистку целевых соединений и представляет собой экономичную замену сыворотки. CDM-HD доступна в виде сухого порошка для приготовления одного литра состава и используется в концентрации 10%. В таблице представлены различия по составу в компонентах сухой питательной смеси CDM-HD и стандартной культуральной среде.

Компоненты присутствуют в составе CDM-HD Компоненты отсутствуют в составе CDM-HD

Подобранное соотношение аминокислот и метаболитов	Белок
Витамины и кофакторы	Гидролизаты
Микроэлементы	Неопределённые реагенты
Микро-питательные вещества	Компоненты животного происхождения
Дополнительная буферная емкость	Стероидные гармоны или пептидные митогены
Рекомбинантные факторы роста	Феноловый красный
Карбоксилаты, включая глюкозу 1 г/л	Плюрионовый детергент
Низкомолекулярные компоненты, с MW не выше 3 кДа	Высокомолекулярные соединения , включая синтетические полимеры

На рисунке представлено сравнение неочищенных супернатантов гибридомы, полученных в модели картриджа (2011) при использовании культуральной среды DMEM с разными добавками: DMEM с FBS (10%) и DMEM с CDM-HD (10%).

SDS-полиакриламидный гель белковых проб (антитела) из супернатанта, полученного при помощи технологии FiberCell systems™.

Секретируемые антитела по технологии из FiberCell Systems, получаются высокой степени чистоты с сохранением функциональной активности.
Дорожка 1: контроль, нанесение 3 мкг
Дорожка 2, 3 и 4: неочищенные продуценты из картриджа, пробы взяты на 7, 9 и 12-й день (DMEM и CDM-HD (10%)), нанесение 2 мкл
Дорожка 5: 10-кр. концентрированный супернатант из Т-флакона (с использованием DMEM и CDM-HD (10%)), нанесение 2 мкл
Дорожка 6: Т-флакон (c использованием DMEM и FBS-сыворотки (10%)), нанесение 2 мкл
Концентрация супернатанта, полученного из картриджа : 2,5 мг/мл.

Список публикаций:

Large-scale preparation of extracellular vesicles enriched with specific micro-RNA: Yoo, KW et al. ; Tissue Engineering. 2018 [abstract]

Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles: Watson DC et al.; Biomaterials 105, 2016: 195-205 [Open Access]

Efficient production and purification of recombinant human interleukin-12 (IL-12) overexpressed in mammalian cells without affinity tag: Jayanthi S. et al.; Protein Expr Purif. 2014 Oct; 102: 76–84. [Open Access]

Подробнее ознакомиться с технологией подготовки сухой смеси CDM-HD для использования можно в брошюре.

Подробнее ознакомиться с паспортом безопасности cухой смеси CDM-HD можно в брошюре.

Подробнее ознакомиться с физико-химическими характеристиками сухой смеси CDM-HD можно в брошюре

Анализатор (GlucCell™ FiberCell Systems, Inc.)

Углеводы в форме сахаров являются основным источником энергии для культивируемых клеток. В зависимости от метаболической активности клеток и скорости их пролиферации для поддержания культур некоторых типов клеток требуется большее количество питательных веществ. Для роста клеток с различным уровнем метаболизма необходимо использовать повышенные или пониженные концентрации глюкозы. Однако применение среды c повышенной концентрацией глюкозы для культивирования активно пролиферирующих клеток может приводить к быстрому накоплению в среде таких метаболитов, как лактат (в искусственной среде клетки получают энергию преимущественно за счет гликолиза), что вызывает снижение рН раствора и изменению цвета культуральной среды.

Для поддержания оптимального роста клеток и определения необходимости замены культуральной среды в системе FiberCell Systems™ необходимо точно знать концентрацию глюкозы. Для точного измерения количества глюкозы в культуральной среде рекомендуется использовать электрохимический анализатор GlucCell™. НЕЛЬЗЯ применять глюкометр для измерения уровня глюкозы (сахара) в крови. Прибор GlucCell™ откалиброван для работы с клеточными культурами млекопитающих или насекомых. На измерение можно отобрать 1,5 мкл суспензии клеток. Результат показывается на жидкокристаллическом мониторе через 15 сек., воспроизводимость данных составляет >90%, погрешность — <5%.

Технические характеристики

Размер	96 мм х 60 мм х 18,5 мм
Вес	70 гр. c элемент питания
Источник питания	литий-ионный элемент питания на 3 Вольта, CR2032
Время работы	для проведения 1000 тестов
Дисплей	жидко-кристаллический дисплей
Автоматизация	детекция электрода при вставлении в прибор, обнаружение загрузки образца, обратный отсчет времени реакции, выключение после завершения измерения
Память	сохранение результатов 180 тестов
Окружающие условия	10-40 С⁰
Объем исследуемого образца	3 мкл
Диапазон измерений:.	30-500 мг/дл (1,6-33,3 ммоль/л)
Время на проведения теста и получения результата	< 15 секунд